Как провести окрашивание по Граму

Окрашивание по Граму — это метод исследования, позволяющий установить наличие бактерий, и дифференцировать их как грамположительных, либо грамотрицательных. Метод основан на биохимических свойствах клеточной стенки.[1] Метод Грама почти всегда применяют для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

Метод был предложен в 1884 году датским врачом Г.К.Грамом, который разработал и опубликовал его в 1884 году, как способ дифференцировать сходные по симптомам инфекции (Streptococcus pneumoniae (пневмококк) и Klebsiella pneumoniae.[2]

Шаги

1. 1 Приготовьте образец для исследования. Например, если вы подозреваете пневмонию, вам потребуется образец мокроты. Если инфекцию мочевыводящих путей — возьмите образец мочи. Для исследования кишечных инфекций нужен образец кала. Для исследования инфекций мозга потребуется спинномозговая жидкость (исследуется осадок после центрифугирования). Для кожной инфекции проведите биопсию кожи. Инфекции среднего уха исследуют по жидкости из среднего уха (после центрифугирования жидкость разделяется на три слоя, вам нужен средний). Любая ткань человека может быть использована для исследования.
2. 2 Поместите одну-две капли образца на предметное стекло. Распределите мазок тонким слоем по стеклу, например краем другого стекла. Пусть образец высохнет.
3. 3 Зафиксируйте мазок, для чего плавным движением проведите предметным стеклом 2-3 раза над верхней частью пламени горелки, также можно нагреть образец на электрическом нагревателе. Не перегревайте стекло. Мазок можно зафиксировать и метиловым спиртом. Добавьте 1-2 капли на высушенный образец, слейте излишки спирта и высушите. Второй способ предпочтительней, в силу того, что он меньше повреждает исследуемый образец.
4. 4 Нанесите на образец раствор кристаллического фиолетового. Подождите тридцать секунд. Кристаллический фиолетовый в водных растворах выделяет ионы хлора (Cl-). Грамположительные бактерии прочно окрашиваются раствором после обработки йодом. Грамотрицательные бактерии образуют с кристаллвиолетом и йодом легко разрушающееся под действием этанола соединение.
5. 5 Аккуратно смойте краситель водой. Слишком сильный напор может смыть грамположительные бактерии, будьте осторожны.
6. 6 Нанесите йод как минимум на три секунды. Йод фиксирует окраску.
7. 7 Аккуратно смойте водой.
8. 8 Обесцвечивайте мазок, наливая на предметное стекло этанол или ацетон, продолжайте процедуру, пока стекающая жидкость не станет чистой. Если вы вовремя не остановитесь, обесцвечивание может затронуть и грамположительные бактерии тоже.
   • У грамположительных бактерий клеточные стенки содержат мало липидов, а у грамотрицательных клеточные стенки наоборот богаты липидами. В процессе грамотрицательные бактерии теряют внешнюю мембрану, поэтому при обесцвечивании краситель вымывается. Грамположительные бактерии, напротив образуют прочное соединение с красителем.
9. 9 Аккуратно смойте обесцвечивающий раствор водой.
10. 10 Нанесите сафранин на тридцать секунд. Этот раствор окрашивает грамотрицательные бактерии в розовый или красный цвет.[3][4] Фуксин лучше выявляет анаэробные бактерии, его можно использовать вместо сафранина.
11. 11 Аккуратно смойте излишки сафранина.
12. 12 Высушите образец. Готово.
13. 13 Изучите образец под микроскопом. Грамположительные сохраняют фиолетовый цвет. Грамотрицательные выглядят розовыми. Дальнейшая классификация состоит в определении формы бактерии. Часто это бывают кокки (округлые) и бациллы (палочковидные). Классификация:
    • Грамположительные кокки - как правило это стафилококки (в виде виноградных гроздьев) или стрептококки (образуют цепочки).
    • Грамположительные палочки включают в себя бациллы, клостридии, и Листерию. Также можно обнаружить возбудитель дифтерии.
    • Грамотрицательные кокки чаще всего представлены различными видами Neisseria.
    • Грамотрицательные палочки подразделяются на:
      • Грамотрицательные "коккобактерии", например Bordetella, Brucella, Haemophilus, Pasteurella.
      • Прочие грамотрицательные палочки (не коккобактерии), например E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, и многие другие.

Советы

• Используйте только чистые предметные стекла.
• Не перегревайте.
• Смывайте осторожно.
• Мазок должен быть тонким.
• Готовьте образец правильно.
• При обесцвечивании этиловый спирт действует медленнее, чем ацетон.
• Соблюдайте меры предосторожности, и обязательно надевайте перчатки.
• Предметное стекло можно вымыть или использовать только новые.

Предупреждения

• Йод опасен. Не вдыхайте и не глотайте йод, избегайте контакта с кожей. Используйте перчатки, работайте в вентилируемом помещении.
• Ацетон и спирт огнеопасны. Ацетон обезжиривает кожу. Соблюдайте меры предосторожности.

Что вам понадобится

• Образец исследуемой ткани
• Центрифуга
• Предметные стекла
• Пипетка
• Горелка, нагреватель, или метанол
• Вода
• Кристаллвиолет
• Йод
• Этанол или ацетон
• Сафранин